Lĩnh vực kỹ thuật được đề cập

Sáng chế đề cập đến dược phẩm sử dụng chất chiết từ Cordyceps militaris, và cụ thể hơn là sử dụng chất chiết từ Cordyceps militaris để điều trị bệnh thận.

Tình trạng kỹ thuật của sáng chế

Tế bào nang (podocyte) là nhóm tế bào tồn tại trong bao Bowman của thận và bao quanh các mao mạch cầu thận. Bao Bowman có thể giữ lại các phân tử lớn như protein, tế bào hồng cầu hoặc tiểu cầu và vận chuyển các phân tử nhỏ, chẳng hạn như nước, muối hoặc đường, đến khoang Bowman để lọc máu và do đó tạo thành nước tiểu.

Tế bào nang còn được gọi là tế bào có chân, và màng ngăn được hình thành giữa hai chân liền kề. Màng ngăn chịu trách nhiệm lọc máu trong bao Bowman và có protein, ví dụ: nephrin, podocin, NEPH1, NEPH2 và CD2AP, để duy trì chức năng sinh học của nó.

Do đó, sự điều chỉnh giảm mức protein sẽ làm mất chức năng lọc máu của thận.

Do đó, yêu cầu đặt ra là cần phát triển loại thuốc mới để điều trị bệnh thận.

Bản chất kỹ thuật của sáng chế

Sáng chế được thực hiện dựa trên phát hiện chất chiết từ ​​Cordyceps militaris có thể thúc đẩy mức protein nephrin trong tế bào nang của người và giảm mức protein actin (α-SMA).

Sáng chế còn được thực hiện dựa trên phát hiện chất chiết từ ​​Cordyceps militaris có thể làm giảm sự xơ hóa mô kẽ, tích tụ chất nền ngoại bào và xơ hóa cầu thận ở thận chuột, đặc biệt là ở thận của chuột bị tắc nghẽn niệu quản một bên (UUO).

Do đó, theo phương án thực hiện, sáng chế đề xuất phương pháp điều trị bệnh thận, và phương pháp bao gồm (các) bước: sử dụng chất chiết Cordyceps militaris cho bệnh nhân.

Bệnh thận có thể là bệnh thận mãn tính (CKD), bệnh thận do tiểu đường hoặc xơ hóa thận.

Chất chiết Cordyceps militaris được sử dụng cho bệnh nhân với liều lượng 150-800 mg/kg thể trọng.

Chất chiết Cordyceps militaris là chất chiết trong etanol.

Chất chiết Cordyceps militaris được sử dụng cho bệnh nhân ở dạng dung dịch thu được bằng cách trộn chất chiết Cordyceps militaris với dung môi.

Chất chiết Cordyceps militaris có chứa β-sitostenone, cordycepin, hoặc cả hai.

Chất chiết Cordyceps militaris được sản xuất theo phương pháp bao gồm các bước: nghiền quả thể của Cordyceps militaris thành bột; trộn bột Cordyceps militaris với etanol để thu được hỗn hợp; lọc hỗn hợp để thu được dịch lọc; và làm khô dịch lọc để thu được chất chiết Cordyceps militaris.

Bột Cordyceps militaris và etanol được trộn theo tỷ lệ khối lượng trên thể tích từ 1: 5 đến 1:15.

Sáng chế cũng đề xuất phương pháp thúc đẩy mức protein nephrin trong tế bào và phương pháp bao gồm các bước: ủ tế bào bằng chất chiết Cordyceps militaris.

Chất chiết Cordyceps militaris được ủ với tế bào ở dạng dung dịch thu được bằng cách trộn chất chiết Cordyceps militaris với dung môi.

Chất chiết Cordyceps militaris có chứa β-sitostenone, cordycepin hoặc cả hai.

Sáng chế cũng đề xuất phương pháp hạ mức protein actin cơ trơn α trong tế bào và phương pháp bao gồm các bước: ủ tế bào bằng chất chiết Cordyceps militaris.

Mô tả vắn tắt các hình vẽ

Hình 1 là biểu đồ cột minh họa mức protein nephrin trong tế bào nang AB8/13 của người sau khi điều trị bằng các chất khác nhau;

Hình 2 là biểu đồ hình cột minh họa mức protein actin cơ trơn trong tế bào nang AB8/13 của người sau khi điều trị bằng các chất khác nhau;

Hình 3 là biểu đồ cột minh họa mức protein nephrin trong tế bào nang AB8/13 của người sau khi điều trị bằng các chất khác nhau;

Hình 4 là biểu đồ cột minh họa mức độ xơ hóa mô kẽ thận ở chuột;

Hình 5 là biểu đồ cột minh họa mức độ tích lũy chất nền ngoại bào của thận ở chuột;

Hình 6 là biểu đồ cột minh họa mức độ xơ hóa cầu thận ở chuột.

Mô tả chi tiết sáng chế

Chất chiết từ Cordyceps militaris

Sau khi quả thể của Cordyceps militaris được nghiền thành bột, 50 g bột Cordyceps militaris và dung dịch etanol 95% được trộn theo tỷ lệ trọng lượng trên thể tích 1:10. Sau khi hỗn hợp thu được được lắc ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ, dịch nổi phía trên được đem đi lọc. Cuối cùng, chất lỏng đã lọc được làm khô trong chân không để thu được chất chiết Cordyceps militaris (13,16 g) dưới dạng xi-rô màu nâu.

Để thực hiện xét nghiệm sinh học như được mô tả dưới đây và/hoặc các xét nghiệm sinh học khác không được cung cấp trong đó, dịch chiết thu được được hòa tan trong dung môi, ví dụ: dimetyl sulfoxit (DMSO), nước muối đệm phosphat (PBS), hoặc nước cất khử ion (nước dd). Cần lưu ý rằng nồng độ được mô tả dưới đây là tỷ lệ giữa trọng lượng của chất chiết Cordyceps militaris với tổng thể tích của chất chiết Cordyceps militaris và dung môi.

Ngoài ra, theo kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), dịch chiết ít nhất chứa β-sitostenone và cordycepin.

Xét nghiệm In vitro

Đầu tiên, các tế bào nang AB8/13 của người được ủ trong tủ ấm 33^oC chứa 5% carbon dioxit cho đến khi chúng phát triển đến mức hợp lưu là 80%. Các tế bào được chuyển sang tủ ấm 37,5^oC có chứa 5% carbon dioxit để ủ trong 14 ngày để các tế bào được biệt hóa. Sau đó, các tế bào đã biệt hóa được ủ với môi trường nuôi cấy chứa nhiều chất khác nhau trong 6 ngày. Cuối cùng, tổng số protein của các tế bào biệt hóa được xử lý bằng các chất khác nhau đã được chiết xuất cho phân tích Western blotting .

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 (TGF-β1) được biểu hiện nhiều trong mô thận của bệnh nhân bệnh thận do đái tháo đường, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 có thể phân biệt các tế bào podocyte đã biệt hóa và gây ra sự biến mất của các vỏ giả. Bên cạnh đó, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 tham gia vào quá trình xơ hóa thận, thoái hóa nhu mô thận và mất chức năng liên quan đến bệnh thận mãn tính. Vì những lý do trên, tế bào tế bào nang được xử lý bằng yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 có thể được sử dụng làm mô hình nuôi cấy tế bào cho bệnh thận.

Như được minh họa trên Hình 1, so với dimetyl sulfoxit, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 có thể điều chỉnh giảm mức protein nephrin trong tế bào nang AB8/13 của người, và chất chiết Cordyceps militaris có thể điều chỉnh mức protein như vậy trong tế bào nang AB8/13 của người. Hơn nữa, chất chiết Cordyceps militaris và yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 có thể cùng nhau duy trì mức protein nephrin trong tế bào tế bào nang AB8/13 của người, điều này cho thấy rằng chất chiết Cordyceps militaris có thể bù đắp cho mức protein nephrin thấp do yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 gây ra. Như được mô tả trong “BỐI CẢNH CỦA SÁNG KIẾN”, nephrin là protein để duy trì màng ngăn; nghĩa là, chất chiết Cordyceps militaris thể hiện chức năng duy trì màng ngăn của ống thận.

Như được minh họa trên Hình 2, so với dimetyl sulfoxit, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 có thể điều chỉnh mức protein actin a-cơ trơn trong tế bào tế bào nang AB8/13 của người; chất chiết từ ​​Cordyceps militaris có thể duy trì mức protein như vậy trong tế bào tế bào nang AB8/13 của người trong điều kiện tế bào được xử lý có hoặc không có yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1. Điều này chỉ ra rằng chất chiết Cordyceps militaris có thể làm giảm mức protein actin cơ trơn cao do chuyển đổi yếu tố tăng trưởng-β1. Nói chung, α-actin cơ trơn có thể biến đổi các tế bào tế bào nang đã biệt hóa thành các nguyên bào sợi có nguồn gốc từ các tế bào podocyte không biệt hóa. Do đó, chất chiết Cordyceps militaris có thể duy trì các tế bào tế bào nang đã biệt hóa để thể hiện chức năng duy trì các màng ngăn của ống thận.

Như được minh họa trên Hình 3, so với dimetyl sulfoxit, glucose cao có thể điều hòa mức protein nephrin trong tế bào tế bào nang AB8/13 của người; chất chiết Cordyceps militaris không chỉ có thể điều chỉnh mức protein trong tế bào tế bào nang AB8/13 của người, mà còn có thể bù đắp cho mức protein nephrin thấp do glucose cao.

Như đã mô tả ở trên, chất chiết Cordyceps militaris có thể thúc đẩy mức protein nephrin và ức chế mức protein actin cơ trơn trong ống nghiệm; do đó, chất chiết Cordyceps militaris có khả năng điều trị bệnh thận, đặc biệt là bệnh thận do tiểu đường và bệnh thận mãn tính.

Xét nghiệm In vivo

Chuột được phân nhóm thành nhóm đối chứng giả, nhóm chỉ tắc nghẽn niệu quản một bên, nhó tắc nghẽn niệu quản một bên kết hợp với nhóm điều trị nước muối đệm phosphat, và nhóm tắc nghẽn niệu quản một bên kết hợp với nhóm điều trị chất chiết từ ​​Cordyceps militaris. Sau đó, phẫu thuật tắc nghẽn niệu quản một bên được thực hiện trên chuột của ba nhóm sau. Sau hai ngày, những con chuột bị tắc nghẽn niệu quản một bên kết hợp với nhóm điều trị muối đệm phosphat, và những con chuột bị tắc nghẽn niệu quản một bên kết hợp với nhóm điều trị chất chiết Cordyceps militaris được điều trị bằng đường uống với các chất tương ứng. Vào ngày thứ 7 sau khi điều trị, thận của tất cả chuột được cắt lát và nhuộm màu để đánh giá mức độ xơ hóa mô kẽ thận, mức độ tích tụ chất nền ngoại bào thận và mức độ xơ hóa cầu thận. Điểm đánh giá dao động từ 1 đến 5; nếu điểm là 5, nó chỉ ra xơ hóa mô kẽ thận, tích tụ chất nền ngoại bào thận, hoặc xơ hóa cầu thận ở mức độ nặng nhất, và nếu điểm là 1, nó chỉ ra xơ hóa mô kẽ thận, tích tụ chất nền ngoại bào thận, hoặc xơ hóa cầu thận ở mức độ nhẹ nhất.

Như được minh họa trên các Hình 4-6, phẫu thuật tắc nghẽn niệu quản một bên có thể dẫn đến xơ hóa mô kẽ thận, tích tụ chất nền ngoại bào thận và xơ hóa cầu thận của chuột. So với nước muối đệm phosphat, chất chiết Cordyceps militaris có thể làm chậm mức độ xơ hóa mô kẽ thận cao, mức độ tích tụ chất nền ngoại bào ở thận cao và mức độ xơ hóa cầu thận cao do tắc nghẽn niệu quản một bên.

Như đã mô tả ở trên, chất chiết Cordyceps militaris có thể chữa xơ hóa mô kẽ thận, tích tụ chất nền ngoại bào ở thận, và xơ hóa cầu thận in vivo; do đó, chất chiết Cordyceps militaris có khả năng điều trị bệnh thận, đặc biệt là bệnh xơ thận.

Mặc dù sáng chế đã được mô tả thông qua các phương án thực hiện cùng với các hình vẽ kèm theo, tuy nhiên, các phương án thực hiện được mô tả chỉ nhằm mục đích minh họa mà không giới hạn phạm vi của sáng chế.